初發(fā)酵實驗 發(fā)酵管內裝有單倍或三倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)液，并在內倒置有小玻璃管。每個樣品用三個不同的水樣量接種，同一接種水樣量要有五管，將水樣分別接種到裝有乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的發(fā)酵管中，在37℃±0.5℃下培養(yǎng)24h±2h。乳糖能起選擇作用，因為很多細菌不能發(fā)酵乳糖，而大腸菌群能發(fā)酵乳糖并產酸產氣???培養(yǎng)液中加入溴甲酚紫作為酸度指示劑，細菌產酸后，培養(yǎng)液即由原來的紫色變成黃色。產酸產氣的發(fā)酵管表明試驗陽性，如在倒管內產氣不明顯，可輕拍發(fā)酵管，有小氣泡升起為陽性。

    復發(fā)酵實驗輕微振蕩初發(fā)酵試驗陽性結果的發(fā)酵管，用3mm接種環(huán)將培養(yǎng)物(2-3環(huán))轉接到EC培養(yǎng)液中，在44.5℃±0.5℃下培養(yǎng)24h±2h(提高培養(yǎng)溫度可造成不利于來自自然環(huán)境的大腸菌群的生長)。培養(yǎng)后立即觀察，發(fā)酵管產氣則證實為糞大腸菌群陽性。

    2.濾膜法

    濾膜是一種微孔性濾膜，孔徑0.45μm。將水樣注入已滅菌的放有濾膜的過濾器中，經過抽濾，細菌即被截留在膜上，然后將濾膜貼于M-FC培養(yǎng)基上，在44.5℃±0.5℃下培養(yǎng)24 h±2h。糞大腸菌群菌落在M-FC培養(yǎng)基上呈藍色或藍綠色，其他非糞大腸菌群菌落成灰色、淡黃色或無色。正常情況下，由于溫度和玫瑰酸鹽試劑的選擇性作用，在M-FC培養(yǎng)基上很少見到非糞大腸菌菌落。

    二.兩種方法的注意事項

    1.培養(yǎng)溫度的要求 總大腸菌群中的細菌除生活在腸道中外，在自然環(huán)境中的水與土壤中也經常存在，但此等在自然環(huán)境中生活的大腸菌群培養(yǎng)的zui合適溫度為25℃左右，如在37℃培養(yǎng)則仍可生長，但如將培養(yǎng)溫度再升高至44.5℃，則不再生長，而直接來自糞便的大腸菌群細菌，習慣于37℃左右生長，如將培養(yǎng)溫度升高至44.5℃仍可繼續(xù)生長。因此，可用提高培養(yǎng)溫度的方法將自然環(huán)境中的大腸菌群與糞便中的大腸菌群區(qū)分，兩種方法也都基于此理。將接種好的樣品或裝有濾膜的培養(yǎng)基放入生化培養(yǎng)箱時，箱內溫度一定要達到所要求的溫度(44.5±0.5℃)時，方可放入。如用恒溫水浴箱時，其水面要高于接種物面，放濾膜的培養(yǎng)皿要沉到水浴箱底部。

    2.加氯水樣的處理 經氯處理消毒過的水樣，水中含有一定量的余氯，使大腸菌群處于受損或受抑制狀態(tài)，在采集水樣時應提前在采樣瓶中加硫代硫酸鈉，硫代硫酸鈉可以脫氯，使受損的細菌得以復蘇與修復，從而避免出現計數結果偏低甚至假陰性的現象。此外余氯對濾膜法培養(yǎng)的細菌其抑制作用尤為明顯，所以抽濾時應對水樣進行大量無菌水稀釋，以減少余氯的殘留。

    3.樣品的保存采樣用的容器使用前應蓋好瓶蓋，用牛皮紙將瓶蓋和瓶頸處包裹好，置干燥箱160℃-170℃干熱滅菌2h，或用高壓蒸汽滅菌器121℃滅菌15min。采樣后水樣的正確保存也很重要，如保存不當可使樣品中的大腸菌群細菌死亡或在一定條件下再生長，這些都將影響檢測結果的準確性。檢測室接到水樣后，應立即檢測，如因故不能檢測時，應立即將樣品置于冰箱內(2℃-10℃)并于2小時內檢測。

    4.培養(yǎng)物質的制備與保存

    ⑴.多管發(fā)酵法所使用的培養(yǎng)液在分裝于各發(fā)酵管中后，應將發(fā)酵管盡快放于高壓蒸汽滅菌器中，在115℃滅菌20min(注意：這個溫度也應控制好，既達到滅菌的作用，還要防止培養(yǎng)物質分解流失)，然后貯存于冰箱或暗處備用。

    ⑵.濾膜法所采用的M-FC培養(yǎng)基多使用外購的成品，培養(yǎng)基中苯胺藍的純度和質量往往影響菌落的顏色，因此，無菌包裝的成套培養(yǎng)基在使用前，先接種典型糞大腸菌，以觀察對比菌落的顏色，來鑒定其穩(wěn)定性。

    5.結果統(tǒng)計

    ⑴.多管發(fā)酵法的結果是根據不同接種量的發(fā)酵管所出現陽性結果的數目，從MPN表中查得相應的MPN指數，來計算每升水中糞大腸菌群細菌的MPN值。MPN是“Most Probable Number”的縮寫，指zui大可能數，它是根據統(tǒng)計學理論，估計水體中的菌群密度和衛(wèi)生質量的一種方法，所以準確判斷不同接種量發(fā)酵管的陽性數是非常重要的，否則將導致較大偏差。

    ⑵.濾膜法的結果是計數濾膜上呈藍或藍綠色的菌落，來計算出每升水樣中的糞大腸菌群數。所以為便于計數，減少誤差，理想的水樣體積是一片濾膜上生長20-60個糞大腸菌群菌落。